样本的准备是开始蛋白组项目的第一步,也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时,合理,后续实验数据有代表性,挖掘数据时更有针对性。
科学基础研究中,常见的样本类型包括动物组织样本,细胞样本,血液样本,FFPE样本,体液样本,植物样本等。下面从蛋白组样本送样量、不同样本类型制备流程来进行详细阐述,帮助老师顺利开展实验~~~
一、建议样本送样量
1.1常规蛋白组建议送样量
1.2修饰蛋白组建议送样量
二、蛋白组样本准备指南
2.1 常见动物组织(心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、肌肉等)
PBS洗涤去除残留血液和污染物,剔除无关的干扰组织(血管、脂肪、结缔组织等),冲洗干净,用组织剪或手术刀将组织分离成1 cm3左右的小块,液氮速冻5 min,保存在-80 ℃,干冰运输。
2.2 悬浮培养细胞
1) 连同培养基转移到50 mL离心管中;
2) 4 ℃,1000×g离心10 min收集细胞(1×107 个细胞为宜),弃上清;
3) 用预冷的PBS小心重悬清洗沉淀一次,1 ml PBS重悬细胞后转移到新的1.5 ml离心管中,1000×g 离心10 min,收集细胞,弃上清;
4) -80 °C冻存,干冰寄送。
注意事项:
1) 操作尽量迅速,培养基尽量倒干净,建议用滤纸将残留的培养基吸尽。
2) 取对数生长期,培养至同一时期的细胞,建议多准备样本,以备后续使用。
2.3 贴壁培养细胞
1) 用移液器吸除培养基;
2) 加入灭菌PBS(若用移液枪加,则靠着培养皿壁加入,以免将细胞冲起),平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞, 然后弃PBS;
3) 用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧(动作要快),将细胞尽量全部转移至离心管中;
4) 细胞刮之后,可以用PBS再涮洗一下,转移到离心管,最后再简单离心收集沉淀;
5) 液氮速冻5 min,保存于-80 ℃,干冰寄送。
2.4 血清
1) 使用采血管收集血液(若含有促凝剂,需轻轻地上下颠倒混匀5~10次);
2) 室温静置30-60 min,让全血凝集(如果不能及时离心,可以在室温放置30-60 min之后转移至4 ℃,放置不超过4 h要分离血清;);
3) 4 ℃ 1500-2000×g离心10 min,取上清;
4) 用移液器将上层淡黄色血清转移到离心管中,每管0.2 mL,加入蛋白酶抑制剂,混匀,瞬时离心;
5) 液氮速冻5 min,保存于-80 ℃。
2.5 血浆
1) 使用抗凝管采集全血,颠倒混匀8~10次,4℃ 1300-2000×g离心10 min,取上清;
2) 用移液器将血浆转移到离心管中,加入蛋白酶抑制剂,混匀,瞬时离心;
3) 液氮速冻5 min,保存于-80 ℃。
注意:EDTA,肝素钠和柠檬酸钠的抗凝管都可进行蛋白组实验,但如果做同时要做代谢建议不采用柠檬酸钠,要做转录组的不要用肝素钠等。
2.6 脑脊液、关节液等体液样本
1000-2000×g 离心5 min,使用0.22 μm滤膜过滤,取上清,液氮速冻5 min,-80 ℃保存,干冰寄送。
2.7 血清血浆-外泌体
1) 用超速离心或其他方法提取外泌体, 用电镜观察外泌体形态(推荐);
2) 液氮速冻5 min,-80 ℃保存,干冰运输,不要冻融。
2.8 细胞上清-外泌体
1) 细胞在合适的培养基中培养至70%面积,去掉培养基,PBS洗三次;
2) 换用无血清培养基生长一定时间(如24 h)后收集,4 ℃ 300×g离心 10 min取出细胞,取上清;
3) 液氮速冻5 min,-80 ℃保存,干冰运输。
2.9 细胞培养上清
1) 在收集前改用不完全培养基培养,即用不加血清的培养基进行培养。
2) 待细胞铺满 80%左右,用移液枪吸取上清。
3) 4 ℃,6000 rpm离心5 min,弃去底部可能出现的固体沉淀。
4) 液氮速冻5 min,冻存在-80 ℃,干冰寄送。
2.10 石蜡样本
提供10μm 的石蜡切片 10 片/sample以上(每个石蜡切片的重量≥1 mg)。
2.11 LC-MS/MS质谱鉴定
a) 胶条样本
胶条或者泳道皆可,建议考马斯亮蓝染色(条带清晰,无降解);请用EP管装好,不用加任何保存液,用冰袋寄送即可,颜色非常浅的条带可取多个重复样本放一起。常温保存,冰袋运输。
b) 蛋白溶液样本
如果是磁珠样本,请不要加loading buffer去煮,直接将连着磁珠的蛋白溶液用干冰寄送就好。(如果需要跑胶,建议加loading buffer去煮;如果不跑胶,则不用添加loading buffer)如果不需要跑胶,直接进行溶液内酶解,然后上质谱即可。-80 ℃冻存,干冰运输。
2.12 植物茎、叶、花、根、树皮、种子等
收集样品,液氮速冻(如样品表面有泥土或明显污染物,需要在液氮速冻前用PBS清洗,吸水纸吸去表面液体),液氮速冻至少5 min,保存-80 ℃。
2.13 细菌
1) 收集菌液,4 ℃,3000-5000×g离心10 min,收集菌体(1×108个细菌为宜),弃上清。
2) 用预冷的PBS小心重悬清洗沉淀3 次,每次4 °C,3000-5000×g离心10 min,弃上清。
3) 收集管底沉淀,液氮速冻5 min,-80 °C冻存,干冰寄送。
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