干货分享 | 单细胞转录组样本收集指南

样本的准备是开始单细胞转录组项目的第一步，也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时，合理，后续实验数据有代表性，挖掘数据时更有针对性。

在单细胞测序技术运用过程中，鉴于目前各大测序建库平台流程大同小异且技术稳定的前提下；单细胞悬液质量成为决定单细胞测序数据质量（捕获细胞数，细胞类型，基因中位数，基因组比对率等指标）的关键；因此总结了以下经验，分享于需要使用单细胞转录组测序的广大科研工作者。

常见的样本类型包括组织样本，细胞样本，血液样本，体液样本，FFPE样本等。下面从样本要求、取样准备、不同样本类型制备流程等来进行详细阐述，以期帮助老师顺利开展实验~~~

一、样本要求

1.1 样本量

1）新鲜组织：样本量 ≥ 0.2 g（至少黄豆大小）；

2）穿刺组织：不少于2条（直径 ≥ 1.5 mm，长度1.5 cm）；

3）细胞悬液：细胞数总量 ≥ 5万，活率≥ 85%；

1.2 单细胞悬液上机标准

1）细胞直径范围7~30 μm；

2）细胞活率：≥ 85%；

3）细胞悬液状态：细胞碎片比率≤10% , 细胞结团比率≤25%，有核率＞70%；

4）细胞总量和密度：细胞数总量 ≥ 5万，细胞密度以 700-1200个/ul 为最佳；

5）细胞悬液中不能存在反转录抑制剂（如：EDTA ），不能含有钙镁离子（Ca2+、Mg2+）。

1.3 单细胞核悬液上机标准

1）细胞直径范围7~30 μm；

2）细胞悬液状态：细胞碎片比率≤10% , 细胞结团比率≤25%，有核率＞70%；

3）细胞总量和密度：细胞悬液总量 ≥ 5万，细胞密度以 700-1200个/ul 为最佳；

二、样本采集指南

2.1 组织样本采集须知

保存液准备：获取/准备组织保存液，根据组织块大小增加组织保存液；推荐Miltenyi 组织保存液（货号 130-100-008）；

组织量要求：（如：癌，癌旁）实体样本采集量 ≥ 0.2 g（黄豆粒大小）新鲜组织；组织较大时，可分割为多颗粒进行保存运输。

组织处理：离体组织需进行修剪，剔除非目标组织，并利用提前 4℃预冷的1×DPBS或生理盐水清洗掉组织表面的血渍和组织碎屑；

保存操作：无尘纸吸净组织表面的液体，转移组织样本于充满预冷组织保存液的螺口冻存管中，拧紧管盖，封口膜封口，后于 4~8℃ 保存/运输（冰袋或碎冰运输）。

2.2 实体组织

2.2.1 新鲜样本

1）手术后将切下的组织浸于 PBS、HBSS 或培养基溶液中移至超净台；

2）用无菌手术刀将组织切割为 5mm³ 大小，约绿豆-黄豆大小；

3）用 PBS、HBSS 或培养基将剪碎后的组织清洗 1-2 次;

4） 将组织保存进美天旎组织保护液中，注意确保样品淹没在保护液中；

5）4℃保存，24-48h 内运输至尊龙凯时生物。

2.2.2 冻存样本

1）取 0.1-1 g 的组织到直径 10 cm的培养皿中，使用已灭菌的剪刀和镊子将组织剪成2-4mm³大小的组织块，同时尽量去除样品上的杂质成分；

2）用 PBS、HBSS 或培养基将剪碎后的组织清洗 1-2 次；

3）转 移 到 冻 存 管 中 ，并 加 入 1 mL 的冻存液对组织块进行重悬混匀，室温放置 10 min；

4）室温条件下准备梯度降温盒，内置新鲜异丙醇，将冻存管放入梯度降温盒， -80℃过夜；

5）冻存好的样品可放置在-80℃低温中进行短期保存，若要长期保存，则需放在液氮中。样品寄送尊龙凯时生物需全程保证干冰运输。

2.3 细胞样本

2.3.1 冻存细胞系

a) 培养的细胞系可通过常温或者低温（4-8℃）寄送样本至公司；

b) 如果是已经冻存的细胞系样本，则可以通过液氮或者干冰寄送单细胞测序实验室，细胞复苏后进行质检。

2.3.2 组织解离后冻存的细胞

解离后的细胞中加入冷冻保护液，将冻存管放入程序降温盒中，直接放入-80度冰箱即可，用干冰寄送单细胞测序实验室，细胞复苏后进行质检。

2.3.3 液体（如：PBMC，粒细胞，积液）中分离的细胞

a) 可通过常温或者低温（4-8℃）寄送样本至公司；

b) 考虑到临床取样的不确定性，对于液体类样本不能及时处理的情况，亦可通过将细胞分离，之后加入冷冻保护液，放入程序降温盒中，直接放入-80度冰箱即可，用干冰寄送单细胞测序实验室，细胞复苏后进行质检。

2.4 类器官样本

2.4.1 解离样本保存方法

1）保持原本培养环境（直接带培养基）低温运输即可， 24-48h 内运输至尊龙凯时生物；

2）将类器官直接加到组织保存液里，4-8℃运输即可， 24-48h 内运输至尊龙凯时生物。

2.4.2 抽核样本冻存方法

1）对培养板每个孔中的类器官进行计数，一般一支2 mL的冻存管冻存200-300个类器官；

2）去除培养基，加入1 ml预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将Matrigel从板底吹起并打碎，移入15ml离心管中；

3）将类器官在4℃，300-500 g离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；

4）依据200-300个类器官/500 μL冻存液（推荐使用Corning  Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积冻存液；

5）重悬后取500 μL转移至冻存管，移入-80℃冰箱，干冰运输。

2.5 液体类样本

液体类组织样本需要注意抗凝，低温冻结，细胞活率变化等情况造成的影响 ，可参考以下建议：

2.5.1 血液，骨髓类样本：需使用 EDTA 抗凝管（紫盖），取大于等于 4 mL 样本量， 取样后充分颠倒混匀，并尽快置于4-8℃保存运输（24-48h 内运输至尊龙凯时生物），血液样本尽量在 8 小时内进行有核细胞分离，且不超过 12 小时。

2.5.2 积液类样本，腹水，胸腔积液，膝盖积液，淋巴液等：取样后置于 4-8℃ 环境进行保存运输。

2.5.3 尿液样本：在取样后应尽快进行细胞分离，如遇特殊情况需加入特定的细胞保护剂维持尿液中的细胞活率。

2.5.4 鼻腔灌洗液，肺泡灌洗液类样本：需要至少 5万个活细胞，根据临床实际情况尽量多拿些样本。

a）可采用直接将灌洗液 4-8℃环境进行保存运输；

b) 灌洗液收集之后，按灌洗液：DMEM培养基（含 10%FBS）=1：3 的比例混合后，4-8℃环境保存运输；

c) 将灌洗液 500g，5min 离心收集细胞后加入一定的细胞培养基（如：DMEM，RPMI 1640、MEM、DMEM/F12等），亦可再向其中添加10% FBS 或 2% BSA的血清进行细胞保护后， 4-8℃环境保存运输。

2.5.5 脑脊液中细胞较为脆弱，提前联系技术人员进行项目沟通。

2.6 FFPE 样本

2.6.1 石蜡样本质检标准

DV200 > 40%：合格；

40% ≥ DV200 > 30%：有一定风险；

DV200 ≤ 30%：风险较大，不建议进行后实验。

2.6.2 石蜡块

石蜡块具有一定的厚度，建议厚度2-5mm，封装，常温或4℃寄送至尊龙凯时实验室。

2.6.3 石蜡包埋的卷片

建议准备3片50um厚度进行正式试验，2张10um进行质检，封装，常温或4℃寄送至尊龙凯时生物实验室。

三、常见问题

3.1 单细胞转录组和单细胞核转录组如何选择？

当组织中关注的细胞类型中含有解离易丢失的、冷冻样本、组织中细胞直径大于 40μm 以及难以消化解离的组织都需要单细胞抽核转录组。其他样本则优先选择做单细胞转录组。

3.2 有哪些常见组织类型必须抽核做单细胞核转录组？

关注神经元的脑组织、关注肝实质细胞的肝脏组织、关注肺上皮细胞的肺组织、关注脂肪细胞的脂肪组织、关注心肌细胞的心脏组织、关注肌肉细胞的肌肉组织、关注神经元细胞的脊髓/脑组织以及关注足细胞的肾脏组织等。

3.3 细胞悬液的制备过程中是否会影响基因的表达？

不管是酶消化还是机械操作都会不可避免的对细胞产生一定的影响，酶消化会使细胞产生应激反应，机械操作则可能损伤细胞，进而影响细胞活性。所以，前期实验设计时，建议设置对照。实验操作中的影响在对照和处理中同样存在，相对可以去除实验的系统误差，在后续结果中找到决定感兴趣生物学过程的关键基因。

3.4 新鲜组织放入保存液后再冷冻，能做单细胞核转录组么？

不行，此操作会形成冰晶破坏细胞和细胞核。

3.5 冻存细胞是否可以做单细胞测序？

梯度冻存的细胞需要安排复苏实验，若复苏后的细胞满足上机需求，是可以进行后续的单细胞测序实验，但因细胞冻存会导致一些细胞的损失，因此后续结果中可能会存在某些细胞类型少或缺失的情况。

3.6 胰腺组织为什么难解离？

胰腺组织中含有大量的消化酶，组织离体后消化酶会在短时间内迅速降解组织细胞内 RNA，而导致解离后细胞活率低。