样本的准备是开始单细胞转录组项目的第一步,也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时,合理,后续实验数据有代表性,挖掘数据时更有针对性。
在单细胞测序技术运用过程中,鉴于目前各大测序建库平台流程大同小异且技术稳定的前提下;单细胞悬液质量成为决定单细胞测序数据质量(捕获细胞数,细胞类型,基因中位数,基因组比对率等指标)的关键;因此总结了以下经验,分享于需要使用单细胞转录组测序的广大科研工作者。
常见的样本类型包括组织样本,细胞样本,血液样本,体液样本,FFPE样本等。下面从样本要求、取样准备、不同样本类型制备流程等来进行详细阐述,以期帮助老师顺利开展实验~~~
一、样本要求
1.1 样本量
1)新鲜组织:样本量 ≥ 0.2 g(至少黄豆大小);
2)穿刺组织:不少于2条(直径 ≥ 1.5 mm,长度1.5 cm);
3)细胞悬液:细胞数总量 ≥ 5万,活率≥ 85%;
1.2 单细胞悬液上机标准
1)细胞直径范围7~30 μm;
2)细胞活率:≥ 85%;
3)细胞悬液状态:细胞碎片比率≤10% , 细胞结团比率≤25%,有核率>70%;
4)细胞总量和密度:细胞数总量 ≥ 5万,细胞密度以 700-1200个/ul 为最佳;
5)细胞悬液中不能存在反转录抑制剂(如:EDTA ),不能含有钙镁离子(Ca2+、Mg2+)。
1.3 单细胞核悬液上机标准
1)细胞直径范围7~30 μm;
2)细胞悬液状态:细胞碎片比率≤10% , 细胞结团比率≤25%,有核率>70%;
3)细胞总量和密度:细胞悬液总量 ≥ 5万,细胞密度以 700-1200个/ul 为最佳;
二、样本采集指南
2.1 组织样本采集须知
保存液准备:获取/准备组织保存液,根据组织块大小增加组织保存液;推荐Miltenyi 组织保存液(货号 130-100-008);
组织量要求:(如:癌,癌旁)实体样本采集量 ≥ 0.2 g(黄豆粒大小)新鲜组织;组织较大时,可分割为多颗粒进行保存运输。
组织处理:离体组织需进行修剪,剔除非目标组织,并利用提前 4℃预冷的1×DPBS或生理盐水清洗掉组织表面的血渍和组织碎屑;
保存操作:无尘纸吸净组织表面的液体,转移组织样本于充满预冷组织保存液的螺口冻存管中,拧紧管盖,封口膜封口,后于 4~8℃ 保存/运输(冰袋或碎冰运输)。
2.2 实体组织
2.2.1 新鲜样本
1)手术后将切下的组织浸于 PBS、HBSS 或培养基溶液中移至超净台;
2)用无菌手术刀将组织切割为 5mm3 大小,约绿豆-黄豆大小;
3)用 PBS、HBSS 或培养基将剪碎后的组织清洗 1-2 次;
4) 将组织保存进美天旎组织保护液中,注意确保样品淹没在保护液中;
5)4℃保存,24-48h 内运输至尊龙凯时生物。
2.2.2 冻存样本
1)取 0.1-1 g 的组织到直径 10 cm的培养皿中,使用已灭菌的剪刀和镊子将组织剪成2-4mm3大小的组织块,同时尽量去除样品上的杂质成分;
2)用 PBS、HBSS 或培养基将剪碎后的组织清洗 1-2 次;
3)转 移 到 冻 存 管 中 ,并 加 入 1 mL 的冻存液对组织块进行重悬混匀,室温放置 10 min;
4)室温条件下准备梯度降温盒,内置新鲜异丙醇,将冻存管放入梯度降温盒, -80℃过夜;
5)冻存好的样品可放置在-80℃低温中进行短期保存,若要长期保存,则需放在液氮中。样品寄送尊龙凯时生物需全程保证干冰运输。
2.3 细胞样本
2.3.1 冻存细胞系
a) 培养的细胞系可通过常温或者低温(4-8℃)寄送样本至公司;
b) 如果是已经冻存的细胞系样本,则可以通过液氮或者干冰寄送单细胞测序实验室,细胞复苏后进行质检。
2.3.2 组织解离后冻存的细胞
解离后的细胞中加入冷冻保护液,将冻存管放入程序降温盒中,直接放入-80度冰箱即可,用干冰寄送单细胞测序实验室,细胞复苏后进行质检。
2.3.3 液体(如:PBMC,粒细胞,积液)中分离的细胞
a) 可通过常温或者低温(4-8℃)寄送样本至公司;
b) 考虑到临床取样的不确定性,对于液体类样本不能及时处理的情况,亦可通过将细胞分离,之后加入冷冻保护液,放入程序降温盒中,直接放入-80度冰箱即可,用干冰寄送单细胞测序实验室,细胞复苏后进行质检。
2.4 类器官样本
2.4.1 解离样本保存方法
1)保持原本培养环境(直接带培养基)低温运输即可, 24-48h 内运输至尊龙凯时生物;
2)将类器官直接加到组织保存液里,4-8℃运输即可, 24-48h 内运输至尊龙凯时生物。
2.4.2 抽核样本冻存方法
1)对培养板每个孔中的类器官进行计数,一般一支2 mL的冻存管冻存200-300个类器官;
2)去除培养基,加入1 ml预冷的含0.1%BSA 的PBS,轻柔吹打3-5次,将Matrigel从板底吹起并打碎,移入15ml离心管中;
3)将类器官在4℃,300-500 g离心5分钟,去除上清,加预冷的PBS重悬,重复清洗过程3-5次直至胶去除干净;最后一次离心后,将上清去除干净;
4)依据200-300个类器官/500 μL冻存液(推荐使用Corning Cat.No.88-702-CB)比例加入相应体积冻存液;
5)重悬后取500 μL转移至冻存管,移入-80℃冰箱,干冰运输。
2.5 液体类样本
液体类组织样本需要注意抗凝,低温冻结,细胞活率变化等情况造成的影响 ,可参考以下建议:
2.5.1 血液,骨髓类样本:需使用 EDTA 抗凝管(紫盖),取大于等于 4 mL 样本量, 取样后充分颠倒混匀,并尽快置于4-8℃保存运输(24-48h 内运输至尊龙凯时生物),血液样本尽量在 8 小时内进行有核细胞分离,且不超过 12 小时。
2.5.2 积液类样本,腹水,胸腔积液,膝盖积液,淋巴液等:取样后置于 4-8℃ 环境进行保存运输。
2.5.3 尿液样本:在取样后应尽快进行细胞分离,如遇特殊情况需加入特定的细胞保护剂维持尿液中的细胞活率。
2.5.4 鼻腔灌洗液,肺泡灌洗液类样本:需要至少 5万个活细胞,根据临床实际情况尽量多拿些样本。
a)可采用直接将灌洗液 4-8℃环境进行保存运输;
b) 灌洗液收集之后,按灌洗液:DMEM培养基(含 10%FBS)=1:3 的比例混合后,4-8℃环境保存运输;
c) 将灌洗液 500g,5min 离心收集细胞后加入一定的细胞培养基(如:DMEM,RPMI 1640、MEM、DMEM/F12等),亦可再向其中添加10% FBS 或 2% BSA的血清进行细胞保护后, 4-8℃环境保存运输。
2.5.5 脑脊液中细胞较为脆弱,提前联系技术人员进行项目沟通。
2.6 FFPE 样本
2.6.1 石蜡样本质检标准
DV200 > 40%:合格;
40% ≥ DV200 > 30%:有一定风险;
DV200 ≤ 30%:风险较大,不建议进行后实验。
2.6.2 石蜡块
石蜡块具有一定的厚度,建议厚度2-5mm,封装,常温或4℃寄送至尊龙凯时实验室。
2.6.3 石蜡包埋的卷片
建议准备3片50um厚度进行正式试验,2张10um进行质检,封装,常温或4℃寄送至尊龙凯时生物实验室。
三、常见问题
3.1 单细胞转录组和单细胞核转录组如何选择?
当组织中关注的细胞类型中含有解离易丢失的、冷冻样本、组织中细胞直径大于 40μm 以及难以消化解离的组织都需要单细胞抽核转录组。其他样本则优先选择做单细胞转录组。
3.2 有哪些常见组织类型必须抽核做单细胞核转录组?
关注神经元的脑组织、关注肝实质细胞的肝脏组织、关注肺上皮细胞的肺组织、关注脂肪细胞的脂肪组织、关注心肌细胞的心脏组织、关注肌肉细胞的肌肉组织、关注神经元细胞的脊髓/脑组织以及关注足细胞的肾脏组织等。
3.3 细胞悬液的制备过程中是否会影响基因的表达?
不管是酶消化还是机械操作都会不可避免的对细胞产生一定的影响,酶消化会使细胞产生应激反应,机械操作则可能损伤细胞,进而影响细胞活性。所以,前期实验设计时,建议设置对照。实验操作中的影响在对照和处理中同样存在,相对可以去除实验的系统误差,在后续结果中找到决定感兴趣生物学过程的关键基因。
3.4 新鲜组织放入保存液后再冷冻,能做单细胞核转录组么?
不行,此操作会形成冰晶破坏细胞和细胞核。
3.5 冻存细胞是否可以做单细胞测序?
梯度冻存的细胞需要安排复苏实验,若复苏后的细胞满足上机需求,是可以进行后续的单细胞测序实验,但因细胞冻存会导致一些细胞的损失,因此后续结果中可能会存在某些细胞类型少或缺失的情况。
3.6 胰腺组织为什么难解离?
胰腺组织中含有大量的消化酶,组织离体后消化酶会在短时间内迅速降解组织细胞内 RNA,而导致解离后细胞活率低。
业务咨询
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