干货分享 | 转录组样本收集指南

样本的准备是开始转录组项目的第一步，也是决定一个项目能否成功的最关键环节。样本取样及时，合理，后续实验数据有代表性，挖掘数据时更有针对性。

科学基础研究中，常见的样本类型包括细胞样本，动物组织样本，血液样本，FFPE样本，体液样本，植物样本等。下面从转录组样本送样量、取样准备、不同样本类型制备流程、及包装和寄送来进行详细阐述，帮助老师顺利开展实验~~~

一、常见转录组项目的样本送样量

二、取样准备

2.1 冻存管

对于液氮保存样品，务必不要使用Eppendorf管或国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂，造成样本损失或实验人员损伤；应选用耐-192 ℃超低温的带螺纹口的冻存管，样本采集后，迅速放入进口冻存管中，拧紧后立即放入液氮，再转移到-80℃中保存。

无需液氮保存的样本（如RNAlater中的组织样本或TRIzol处理的细胞样本），可以使用EP管或离心管，请使用封口膜将管口充分封锁。

图1. EP管（左）、离心管（中）和冻存管（右，品牌是Corning）

2.2 TRIzol

TRIzol是一种从细胞和组织中提取total RNA的即用型试剂，其主要成分是苯酚。为了完全抑制RNA酶活性，TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。使用TRIzol保存细胞时，只需要用TRIzol将细胞裂解完全（澄清、透明、无细胞团块），液氮速冻保存即可。保存组织样本时，必须先将组织研磨成粉末或匀浆完全后再保存于TRIzol中，并液氮速冻，严禁直接将组织块放入TRIzol中。

Trizol LS是TRIzol的浓缩形式，可以提高提取的准确性，加快提取反应的速度。对于血液等体积较大的体液样本，建议使用TRIzol LS试剂进行处理。但是需要注意的是，TRIzol处理过的样本同时适合DNA和RNA的提取，而TRIzol LS对RNase有强烈的抑制作用，主要用于RNA的提取。

2.3 RNAlater

RNAlater是一种液态的、无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。后期测序结果表明，RNA测序组织保护液处理组的样本一致性先显著优于液氮速冻处理的样本。因此强烈推荐客户优先使用RNA组织保护液。

RNAlater只能用于保存新鲜组织，在浸入RNAlater之前不能冷冻组织。首先简单切碎组织样本，至少一边的最大厚度不能大于0.5 cm，然后将组织碎块迅速放入到5-10倍体积的RNAlater中，4 ℃放置过夜（重要）后，转入-80 ℃保存。请注意，RNA组织保护液不能全部装满冻存管或离心管，防止热胀冷缩液体外渗，盖子有条件强烈建议加上封口膜。

三、不同样本类型的制备方法

3.1 　Total RNA

Total RNA样本一般长期保存于-80 ℃冰箱，若要寄送可直接使用干冰寄出。

RNA质量要求：

① RNA纯度：OD260/280值在1.8-2.2之间，无DNA残留。

② RNA完整性：RIN/RQN≥ 6，28S：18S≥ 0.7。

③ RNA浓度：≥30 ng/μL

3.2 细胞样品

3.2.1 贴壁细胞

1) 从培养箱取出贴壁生长细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好后弃培养基；

2) 小心加入与培养基等体积的无酶水配制的1×PBS后，平放1 min洗涤细胞，然后弃尽PBS，重复一次；

3) 加入适量细胞裂解液反复吹打至充分裂解（以TRIzol为例，10-15 cm的大皿或者1×107个细胞左右，每次先添加1mL TRIzol裂解液，吹打混匀，裂解充分标准为吹打后液体不粘稠，无成团细胞块，流动性好。如果液体过于粘稠说明还未裂解充分，需添加裂解液，每次添加的量建议为100 μL左右，持续添加直到液体不粘稠，呈透亮状态为止）；

4) 将裂解好的细胞转移至冻存管后，-80 ℃冰箱长期保存，干冰运输。

3.2.2 悬浮细胞

1) 选取生长状态良好的细胞悬液；

2) 200-1000 g，4 ℃下离心5-10 min，得到细胞沉淀弃培养基（离心参数可参考细胞传代培养要求）；

3) 加入适量（以1×107细胞为例可以加入3 mL）的1×PBS（RNase-free水配制）悬起细胞沉淀，200 g下离心5 min，弃PBS，洗2次；

4) 加入适量细胞裂解液反复吹打至裂解充分（裂解标准同贴壁细胞）；

5) 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3份；

6) 将裂解好的细胞转移至冻存管，-80 ℃冰箱长期保存或干冰运输。

3.3 组织样本

1) 选取新鲜的动物组织，体积尽量控制在长宽高均≤0.5 cm（约一个绿豆大小，见下图）。取材后用RNase-free配制的生理盐水/PBS进行漂洗，去除血渍和污物，并剔除结缔组织等非研究组织；

2) 如初次取出的组织块较大，则可在冰上将样品分割成50 mg左右的小块，以防止样品降解，然后：

a) 先在冻存管中放入0.5-1.5 mL左右的RNA组织保护液，然后将处理好的组织放入冻存管中，保证组织被充分没入。在4 ℃下保存过夜后，在-20 ℃或-80 ℃长期保存（推荐）。

b) 处理好的组织迅速放入预冷的已写好编号的RNase-Free的耐超低温冻存管中，迅速置于液氮速冻1小时后转存于-80 ℃长期保存，在RNA提取前避免反复冻融。

3) 然后将组织样品置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输。

图2.  组织块大小和组织量关系示例

3.4 类器官组织

对于类器官样本，有两种不同的制备方法可供参考。

3.4.1 解离法

1) 去除培养板的孔中的培养基，加入1 mL预冷的含0.1% BSA的1×PBS，轻柔吹打3-5次，将Matrigel（基质胶）从板底吹起并打碎，将悬液移入15 mL离心管中；

2) 将类器官在4 ℃，300-500 g下离心5 min，去除上清。加预冷的1×PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至基质胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；

3) 加入适量裂解液反复吹打至充分裂解（参考悬浮细胞样本制备，裂解液以TRIzol为例）；

4) 转移至耐超低温的螺纹口冻存管后，-80 ℃长期保存，干冰运输。

3.4.2 冻存法

1) 对培养板每个孔中的类器官进行计数，一般一支2 mL的冻存管冻存200-300个类器官；

2) 去除孔中培养基，加入1 mL预冷的含0.1% BSA的1×PBS，轻柔吹打3-5次，将 Matrigel从板底吹起并打碎，将悬液移入15 mL离心管中；

3) 将类器官在4℃，300-500xg离心5分钟，去除上清，加预冷的PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；最后一次离心后，将上清去除干净；

4) 依据200-300个类器官/500 μl冻存液（推荐使用Corning Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积的冻存液；

5) 轻柔重悬类器官后取500 μl转移入耐-192 ℃低温的螺纹口冻存管后，标记好直接移入-80 ℃冰箱；经此方法冻存的类器官可在-80 ℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中；干冰运输。

3.5 血液样本

全血采集方式

推荐使用BD公司的PAXgene采血管收集全血样本，推荐使用真空采血管采集全血后分离血清，以及使用EDTA抗凝管采集全血样本以及分离血浆样本。由于肝素会严重影响PCR酶的逆转录效率，严禁采用肝素采血管采集全血。

图3.  常见采血管

3.5.1 使用PAXgene采血管采集全血

1) 采血前，应将采血管恢复室温，推荐温度为18-25 ℃；

2) 采血时，假如前面已经使用了多种采血管采集血液时，应在最后使用PAXgene采血管；仅用PAXgene采血管时，先用另一个采血管（下图A管-废弃管）采集1-2 mL血样，丢弃该采血管，再使用PAXgene采血管采血；

3) 采血量2.5 mL，采血后，立即上下颠倒混匀10次左右。18-25 ℃正立放置2 h；

4) 若不立即提取，静置后，将样品转入耐低温的冻存管中，然后转移至-80 ℃长期保存或转移至干冰中进行运输；在样品保存及运输过程中应避免反复冻融。

图4. PAXgene采血管采集全血方式

3.5.2 使用EDTA采血管/真空采血管采集全血

1) 样本采集前，先用75%的酒精棉由内向四周对采血部位进行消毒；

2) 采血至特定的采血管中，数量达到负压允许的最大值；

3) 样本采集完成后，立即轻柔颠倒混匀10次。动作尽可能平缓。加入三倍以上体积的TRIzol（TRIzol: 血液≥3: 1）裂解液混匀，此时出现沉淀为正常情况；

4) 混匀完毕后，立刻转入耐低温的螺纹口冻存管，转入-80 ℃冰箱保存，干冰运输。注意采血至提取RNA最长时间不得超过一周。

3.5.3 血浆样本

1) 建议使用紫色EDTA抗凝管收集全血样本；

2) 上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4 °C或冰盒中正立放置；

3) 1200 g下离心10min分离得到上层血浆样本（全血需在1 h内进行血浆分离，依据抗凝管操作说明或客户实验室血浆分离步骤进行操作）；

4) 将血浆转移至1.5 mL离心管中，13000g离心2 min；

5) 将上清转移至规格在200 μL-1.5 mL耐超低温螺纹口冻存管中。如果样本体积较大，建议多次分装成小管，无需反复冻融取样。液氮速冻1 h后，-80 ℃保存，干冰运输。

3.5.4 血清样本

1) 建议使用进口医用血清管或真空采血管等收集全血；

2) 上下轻轻颠倒混匀十次后，立即将全血置于4 °C或冰盒中正立放置；

3) 1800g下离心10min分离得到上层血清样本（全血需在1 h内进行血清分离，依据血清管操作说明或客户实验室血清分离步骤进行操作）；

4) 将血清转移至1.5 mL离心管中，13000 g离心2 min；

5) 将上清转移至规格在200 μL-1.5 mL耐超低温螺纹口冻存管中。如果样本体积较大，建议多次分装成小管，无需反复冻融取样。液氮速冻1 h后-80 ℃保存，干冰运输。

注意事项

a) 分离血清血浆应严格按照操作说明进行，操作需在1 h内完成，避免出现溶血现象，血清血浆分离后避免反复冻融。

b) 血清血浆送样量的原则：越多越好，如果手头上的血清血浆量较少，则有多少就送多少，通常该种类型的样本RNA含量较低，所以需要通过加大样本量以富集足够多的RNA，以保证后续实验的顺利进行。

c) 分离血清/血浆样本的全血不可冷冻，混入的血细胞的样本尽量弃尽，已无法使用。

d) 血清/血浆的RNA得率为2-8 ng/ml，血清/血浆量≥4 ml（从10-15 ml全血中分离）。

溶血现象即因红细胞细胞膜的破裂而导致的红细胞破碎、血红蛋白溢出的现象。溶血可由多种物理或化学因素引起，尤其在人体外，渗透压的变化、机械外力，温度的变化，酸碱度的变化或血液处理的过程中人为添加的一些化学物质，均有可能引起不同程度的溶血。

图5.  不同程度的溶血现象

3.6 细胞上清液、尿液、唾液、脑脊液等其他体液样品

收集细胞上清液、新鲜尿液、唾液、羊水、脑脊液，要确保不能溶血（血液中蛋白会污染样品）；正立置于4° C或冰盒中，转移至RNase-free离心管。

以下操作请在样本收集后1 h内进行，以防RNA降解；

a) 在4 °C，3000 g下离心约10 min，去除细胞及碎片；将上清小心倾倒入新的RNase-free离心管（注意不要转移沉淀），在4 °C，13000 g下离心约2 min，去除残留的碎片及细胞；转移上清至全新的耐超低温螺纹口冻存管中，液氮速冻1 h（可选），严密封口。-80 °C保存，干冰运输。

b) 在体液样本中加入TRIzol LS（如Invitrogen，10296010CN）等处理液体样本较好的裂解液，裂解液和体液的体积比至少为3: 1，液氮速冻后-80 ℃保存，干冰运输。

注意事项

a) 细胞上清液碎片过多，需充分低速离心多次去除碎片；

b) 收集尿液的前一天饮食要清淡，晨起中段尿（临床），晨间1 h的尿液（动物）。唾液搜集前需禁食禁烟禁酒2 h以上，上午9:30-11:30取样，蒸馏水漱口，将唾液吐于无菌痰杯（保持水浴），勿咳痰，采集唾液时间为30 min左右，4 ℃ 10000rpm下离心10 min，取上清，经0.22 μm滤膜过滤除菌。

3.7 FFPE样本

福尔马林固定后石蜡包埋的组织简称为FFPE（Formalin-Fixed Paraffin Embedded）样品。对于FFPE样本，需提供厚度在5-10 μm，组织面积大于25 mm3的石蜡切片10-12张，或者组织净重35 mg以上的石蜡块。FFPE样品常温保存，常温或者冰袋运输即可，需要使用特化的试剂盒抽提和纯化。

3.8 植物组织

1) 对于植物组织，应选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位取材。

2) 从植物体上取下新鲜组织，取材后需用清水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净，吸干；

3) 如果组织体积较大，应在冰上将组织剪切成小块或薄片，然后放入离心管中，每管500 mg左右，准确标记样品名称。或用标记好名称的锡箔纸包裹好；

4) 迅速置于液氮速冻3-4个小时，然后转移至-80 ℃冰箱长期保存，在RNA提取前避免反复冻融；

5) 运送方式：将冻存管置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输。

四、样本标注

所有的样品必须具有清晰的标记，样品冻存，运输可能导致标记模糊，强烈建议使用优质的Mark笔标注样品名称。

1）使用1.5mL的EP管、15mL离心管、50mL离心管装载的样品，标注名称后，额外将样品名称写在标签纸上，一并放入自封袋中。

2）使用锡箔纸包装的组织样品，可将样品名称写在标签纸上，随锡箔纸包裹的样品一并放入自封袋中，自封袋外面再标记上样品名称，做好双保险。

五、不同类型样本的运输条件

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