Sci Transl Med | 东南大学姚红红教授团队揭示LGALS9-CD44信号通路在卒中后脑修复中的重要作用

缺血性中风引发了强烈的神经炎症反应，缺血性中风与多个基因的表达相关联，这些基因对神经炎症在小胶质细胞中的反应。星形胶质细胞、少突胶质细胞和浸润的免疫细胞也显示出对缺血性损伤的分子反应发生了改变。对大脑范围和细胞特异性免疫反应的研究已经使得人们更好地理解了这些细胞之间复杂的依赖性相互作用。然而，目前很少有关于中风损伤中心与周边细胞类型和位置特异性的分子变化的研究。

东南大学姚红红教授和南京航空航天大学王杰教授共同通讯，东南大学医学院韩冰副教授和南京航空航天大学周顺衡博士为第一作者在Science Translational Medicine上发表题为Integrating spatial and single-cell transcriptomics to characterize the molecular and cellular architecture of the ischemic mouse brain的研究论文。该研究使用空间转录组测序和单细胞转录组测序对缺血性卒中模型小鼠大脑的基因表达和细胞特征进行了深入解析。通过细胞外囊泡介导的 LGALS9-CD44 关键信号通路在促进卒中后脑修复中的重要作用，揭示了对小鼠中风模型中周梗死区域的详细分子和细胞特征，提示Lgals9可作为潜在的治疗靶点。

使用10x Visium空间转录组对缺血性卒中模型小鼠大脑（PT）和假手术（Sham）进行检测，获得 19777 个 spots并对其进行聚类，然后将每个spot cluster与小鼠的解剖大脑区域对应，揭示了缺血小鼠大脑中与不同大脑解剖区域相对应的独特基因图谱（图1）。

图 1 缺血性卒中小鼠大脑的空间转录组分析

对空间转录组数据进行进一步分析，以探讨中风对缺血半球不同区域的影响。基于每个不同的空间转录组区域，对其分别分析了 PT 组和Sham组之间的差异表达基因（DEGs）。在缺血区观察到了更多的 DEGs（ICA 有 425 个 DEGs，PIA_P 有 1263 个 DEGs，PIA_D 有 343 个 DEGs）。DEGs 并不局限于局部和外周区域，几乎所有脑区都发现了DEGs（图 2A-B）。

确定了 137 个与 ICA 距离呈负相关的缺血诱导基因（IIGs）（图 2C），这些 IIG 与神经炎症过程有关，如小胶质细胞活化和突触修剪（图 2D-E）。这 137 个 IIGs 包括一些已知的免疫调节剂，如 Galectin 家族基因（Lgals1、Lgals3 和Lgals9）、补体基因（C1qa、C1qb 和C1qc）、 MHC基因（H2-D1和H2-K1）、酪蛋白酶基因（Ctsd、Ctss 和Ctsc）、S100 家族基因（S100a11、S100a13 和S100a16）及干扰素诱导跨膜基因（Ifitm2 和Ifitm3）（图2 F-G）。这些发现表明，免疫相关基因的变化在近端区域占主导地位，而稳态相关基因的变化在远端区域占主导地位。

图 2 缺血诱导基因的空间表达特征

利用scRNA-seq，从PT小鼠和假手术小鼠中共鉴定了9799个细胞（图3A）。根据特定的细胞标记将其注释为 12个细胞类型：小胶质细胞（Tmem119和Siglech）、巨噬细胞（Ms4a7和Pf4）、星形胶质细胞（Mfge8和Aqp4）、OPCs（Pdgfra和Nnat）、少突胶质细胞（Ptgds和Plp1）、单核细胞（Ccr2和Ly6c2）、树突状细胞（H2-Aa和Itgax）、中性粒细胞（S100a8 和S100a9）、NK和T细胞（Cd3e 和Cd3g）、内皮细胞（Ly6c1和Igfbp7）、壁细胞（Tagln和Acta2）及成纤维细胞（Col1a1和Col3a1）（图 3A-C）。

以 scRNA-seq为参考，对空转数据进行注释，确定了scRNA-seq鉴定到所有细胞类型的空间定位。小胶质细胞、巨噬细胞和单核细胞优先分布在 PIA_P，而其他类型的细胞则分布在 PIA_D（图 3D），这表明缺血性大脑中存在区域细胞异质性。

图 3 梗死周围区域的单细胞空间结构

通过细胞通讯分析，发现31条信号通路在12中细胞类型的相互作用过程中发挥作用，包括SPP1、MIF、TNF、CCL、CXCL和Galectin等（图 4A-C）。同时发现Lgals9在PT小鼠中显著上调，qPCR和RNAscope也验证了这一发现（图4D-F）。

LGALS9 驱动的 Galectin 信号通路是缺血性脑卒中后最明显增强的信号通路之一，而LGALS1 和 LGALS3 是小鼠大脑非神经元细胞中另外两种主要的 galectin 配体。因此，也对Lgals1 和Lgals3 的表达进行分析，发现这2个基因在梗死周围区域的表达显著增加。此外，AIS 患者中的 LGALS1、LGALS3 和 LGALS9 均升高。

图 4 梗死周围区域的细胞互作分析

鉴于小胶质细胞和巨噬细胞是缺血小鼠体内两个主要的galectin传出信号源（图4C），因此研究者进行了RNAscope，发现Lgals9在缺血损伤后梗死周围区域小胶质细胞（Tmem119+）中表达（图5A）。进一步重聚类，将小胶质细胞分为5个亚型（MG1-MG5）（图 5B）。Sham组中大多数小胶质细胞是 MG1（63.27%）和 MG2（35.73%），表达典型的小胶质细胞基因（P2ry12和Tmem119）；而MG3（51.68%）、MG4（22.25%）和 MG5（20.22%）主要表达Tspo以及干扰素反应标志物（Ifi27l2a 和Ifitm3），且主要出现在PT小鼠大脑中（图 5C-D）。整合空间转录组和 scRNA-seq数据，揭示了小胶质细胞亚型的空间分布，发现 MG3 和 MG5主要位于 PIA_D，而 MG4 主要位于 PIA_P（图 5E）；且Lgals9 在 MG4 中的表达低于 MG3 和 MG5（图 5F-G）。

进一步探讨了巨噬细胞中Lgals1、Lgals3、Lgals9 的表达特征。重聚类后，巨噬细胞被分为四种亚型，包括单核细胞和巨噬细胞中间态（intMoMac）、高MHCII巨噬细胞（MHCII Mac）、富含趋化因子的巨噬细胞（cheMac）和Arg1 高表达的巨噬细胞（Arg1Mac）（图5H-I）。发现所有巨噬细胞亚型主要位于PIA_P（图 5J）。在cheMac和Arg1Mac中Lgals1表达较高，而Arg1Mac中Lgals3 的表达高于其他巨噬细胞亚型，Lgals9 在 intMoMac 和 Arg1Mac 亚型中的表达高于 MHCII Mac 和 cheMac（图 5K-L）。总之，这些发现了缺血性卒中的小胶质细胞异质性和多重巨噬细胞浸润，揭示了不同的空间亚型群体和特异性基因的表达特征。

图 5 揭示小胶质细胞和巨噬细胞的空间表达异质性

研究者制成了含有 LGALS9 的工程化细胞外囊泡 (EV)，以大脑为靶点（图 6A-D）。WB及ELISA验证表明LGALS9在RVG-EVs中富集（图6E-F）。接下来研究了RVG-LGALS9-EV对小鼠PT功能恢复的影响。与RVG-Vector-EV相比，注射RVG-LGALS9-EVs的小鼠的功能有所改善（图6I-J）。这些结果表明，RVG-EVs介导了LGALS9的脑输送，促进中风小鼠感觉和运动功能的恢复。

图 6 RVG-EVs介导LGALS9的脑输送并促进PT小鼠的功能恢复

CellChat 分析确定了与 LGALS9有益作用相关的细胞相互作用特征。CD44是LGALS9的常见受体之一，且观察到Cd44在某些星形胶质细胞中表达（图 7A）。通过无监督聚类，星形胶质细胞被分为6个细胞亚型（AS1-AS6）（图 7B）。PT 组中 Gfap+ 星形胶质细胞比例增加，而 Mfge8+ 星形胶质细胞的比例下降（图 7C）。Cd44 在 AS6 亚型中高度富集，且RNAscope特异性检测发现AS6（Gfap+Clcf1+）亚型主要存在于 PIA_P 区域，这与激活的小胶质细胞的位置一致（图 7D-F）。

发现RVG-LGALS9-EVs显著抑制了星形胶质细胞的活化，而RVG-LGALS9-EVs+shCd44逆转了这种效应（图 7G-H）。星形胶质细胞特异性敲低Cd44（PT+RVG-LGALS9-EVs+AAV-shCd44）部分逆转了PT+RVG-LGALS9-EVs的治疗效果（图7I-L）。这些发现表明CD44是LGALS9 的下游靶点，且有助于星形胶质细胞活化和小鼠的功能恢复。

图 7 CD44 在星形胶质细胞中介导 LGALS9 的功能

髓鞘再生对于中风恢复至关重要，而OPC有效分化为髓鞘少突胶质细胞对这一过程至关重要，因此进一步分析了Cd44在 OPC 亚型中的特异性表达。对OPC 和少突胶质细胞进行重聚类，共鉴定到了10个亚群，包括1个iGC【高表达Slc1a3、Gfap、Olig1、Olig2】、5个pri-OPC【低表达Pdgfra 和高表达Ppp1r14b、Olig1、Olig2】）、1个OPC【高表达Pdgfra和Cspg4】和3个 M-OL【高表达 Ptgds 和 Plp1】（图 8A）。Cd44 主要在 pri-OPC 亚群中表达，CellChat发现 pri-OPC1 亚型在介导小胶质细胞的LGALS9 信号转导中起主要作用（图 8B）。

为了研究 LGALS9-CD44 相互作用对少突胶质细胞不同阶段的影响，以及对中风后髓鞘再生的影响，基于慢病毒介导的shRNA Cd44递送，对小鼠中风诱导和 EV 治疗后的少突胶质细胞亚群进行了表征（图 8D）。发现LGALS9 显著增加了卒中后梗死周围区域的前少突母细胞（pro-OLs）、未成熟少突胶质细胞（I-OLs）和 M-Ols的数量；而敲低Cd44仅能逆转LGALS9增加的I-Ols数量（图8F-H）。此外，发现LGALS9显著增强了卒中后7天和14天的髓鞘覆盖率，增加了卒中后28天的MBP表达；而敲低Cd44可逆转这一现象（图8I）。这些结果表明LGALS9与CD44相互作用，并通过增加OPC和I-OL的数量来促进卒中后的髓鞘再生。

图 8 Lgals9通过Cd44促进OPC的增殖和分化

单细胞和空转数据的整合确定了缺血相关基因在缺血梗死区的空间定位。细胞通讯分析揭示LGALS9-CD44是缺血损伤后的一个关键信号通路，并确定小胶质细胞和巨噬细胞是中风后半乳糖凝集素的主要来源。细胞外囊泡介导的Lgals9传递改善了PT小鼠的长期功能恢复，而敲除Cd44可部分逆转治疗效果。该研究提供了小鼠中风模型中周梗死区域的基因表达特征和细胞特征，揭示Lgals9是一个潜在的治疗靶点。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.adg1323