浙江大学杨益大/钱鹏旭/金希研究团队揭示肝脏驻留Th1样细胞在原发性胆汁性胆管炎中的促炎作用及JAK/STAT抑制剂的治疗潜力

原发性胆道胆管炎（PBC）是一种以多谱系免疫失调为特征的慢性自身免疫性肝病，可引起炎症、纤维化甚至肝硬化。由于传统检测方法的局限性，PBC的局部肝脏免疫发病机制尚未完全确定。

2024年10月7日，浙江大学杨益大、钱鹏旭及金希共同通讯在Nature Communications上发表题为“Single-cell RNA sequencing reveals the pro-inflammatory roles of liver-resident Th1-like cells in primary biliary cholangitis”的文章。研究利用单细胞RNA测序描绘了PBC患者的免疫细胞图谱，并解析了分子机制。

关键发现包括：

1.免疫细胞景观：单细胞转录组测序揭示了PBC患者肝脏中的免疫细胞景观，胆管细胞和肝星状细胞参与肝脏炎症和纤维化的调控。

2.Kupffer细胞：表现出炎症因子水平增加和清除功能相关基因减少，而T细胞表现出炎症因子水平增加和细胞毒性相关基因减少。

3.Th1样细胞群：在PBC患者和PBC小鼠模型的肝脏中发现了表达JAK-STAT激活的肝脏驻留Th1样细胞群。

4.JAK-STAT通路的阻断：在小鼠PBC模型中阻断JAK-STAT通路可以减轻肝脏炎症并消除肝脏驻留的Th1样细胞。

小结：肝脏驻留的Th1样细胞在PBC的发展中起到了关键的促炎作用，并且JAK-STAT通路的激活与PBC的免疫病理学密切相关。通过JAK抑制剂的治疗可以减轻小鼠模型中的PBC症状，为未来的临床治疗提供了新的思路。

PBC 是一种慢性自身免疫性疾病，表现为门管区免疫细胞浸润，从而引发炎症反应。为了阐明浸润免疫细胞的特征，对 5 名 PBC 患者（未接受过 UDCA 治疗，Nakanuma I~II 期）、5 名肝血管瘤患者（肝健康对照）和 5 名健康供体（PBMC 健康对照）的肝组织和 PBMC 进行 scRNA-seq（图 1a）。分别获得了 51,943 个和 47,644 个人类肝脏和 PBMC 的单细胞转录组，肝脏和 PBMC分别被划分为 22 个和 18 个亚群（图 1b 、c）。在 PBC 患者的肝脏中，Th1 样细胞和 Treg 细胞增加，而 CD16 ⁺单核细胞减少。然而，在 PBMC 中没有发现类似的差异。

为了评估每个细胞亚群的细胞因子和炎症水平，进行了表达分析及评分分析。结果表明，PBC患者肝脏中多个细胞亚群的炎症评分和细胞因子评分较高，尤其是Th1样细胞和CD8 ⁺ Trm细胞（图 1f，g）。然而，PBC患者PBMCs中的免疫细胞仅表现出轻微的炎症变化（图 1g）。总之，这些结果表明这些PBC患者肝脏炎症增加，而外周血中并没有。

图 1 PBC 患者肝脏和 PBMC 的单细胞转录组图谱

对肝脏非免疫细胞进行重聚类后，发现了activated stellate cells，这群细胞高表达与ECM和细胞粘附、ECM受体、免疫排斥和TGF-β通路相关的基因（图 2a-c）。表明活化的星状细胞可能在细胞外基质重塑和最终的肝纤维化中发挥重要作用。

与胆管细胞生理功能相关的几条通路在 PBC 患者的胆管细胞中也显著变化，如胆汁分泌、蛋白消化吸收及谷胱甘肽代谢等。值得注意的是，“bicarbonate secretion”和“碳酸氢根伞”功能维持至关重要的基因，如 CFTR、AQP1、CA2、SLC5A1 和 SLC4A4等，在 PBC胆管细胞中被显著抑制（图 2d），这可能是 PBC 胆管细胞损伤的重要原因。此外，PBC胆管细胞表现出更高的炎症基因表达（CCL2、CXCL8、C3、FGA）和通路活性（Coronavirus disease—COVID-19、Complement and coagulation cascades、Ferroptosis等），暗示胆管细胞衰老并参与胆管炎症反应（图 2e）。最后，发现一些促炎基因在胆管细胞（CCL28、CXCL1、CXCL6）和星状细胞（CCL21、CXCL14、TSLP）中特异性表达，表明这些细胞可能在PBC中发挥特殊的促炎作用。

细胞通讯分析发现PBC中几种与免疫细胞迁移或活化相关的通路得到增强，如CX3CL1-CX3CR1、IL34、CSF1-CSR1R及CXCL12-CXCR4等，令人惊讶的是，CCL21-CCR7在PBC星状细胞中被特异性激活（图 2f、g）。免疫荧光显示，PBC中CCL21 ⁺ αSMA ⁺星状细胞（活化星状细胞）的数量显著增加（图2h）。这些独特的发现表明，高表达CCR7的Naive T细胞和B细胞可能被星状细胞直接募集到局部炎症区域，并在炎症微环境中分别分化为T辅助细胞和浆细胞。

越来越多的数据显示，GDF15在包括PBC在内的慢性肝病患者中升高，并与肝纤维化过程有关。scRNA-seq数据显示GDF15在胆管细胞中特异表达，并在PBC患者中显著升高（图 2g）。免疫荧光证实了GDF15主要由PBC门管区的CK19 ⁺胆管细胞分泌，而胆管反应的增生性胆管细胞也具有GDF15分泌能力（图 2i ），这表明GDF15在肝脏再生和纤维化中具有潜在作用。

图 2 PBC患者肝脏非免疫细胞特征

对髓系细胞进行亚群分析，注释到了一个CD14 ⁺ CD16 ⁺单核细胞（同时高表达 CD14 和 CD16）（图 3a）。PBC患者肝脏中虽然单核细胞数量减少，但Kupffer细胞的细胞因子得分和促炎基因IL1B、CXCL2的表达均增加，TNF表达呈上升趋势（图 3b-d），星状细胞中IL1B受体IL1R1的表达也有上升趋势（图 3e、f），这些结果提示PBC Kupffer细胞和星状细胞之间IL1信号通路增强。此外，还观察到TLR4、MSR1、CD36和MRC1等吞噬作用相关的基因在Kupffer细胞中的表达降低（图 3d）。这些结果暗示Kupffer细胞的促炎作用增强可能加重肝脏局部的炎症反应，而抑制Kupffer细胞的吞噬作用可能减慢衰老胆管细胞和活化星状细胞的清除。

促胰液素 (SCT)/促胰液素受体 (SCTR) 轴是导管胆汁分泌的主要调节器。发现 SCT 在 pDC 中表达（图 3e-g）。由于 SCTR 在胆管细胞中特异性表达和上调，因此理论上 pDC 可能通过调节 PBC 中的导管胆汁分泌发挥直接调节作用（图 3e-h）。综上所述表明 PBC 中肝脏Kupffer细胞的清道夫功能降低，炎症功能增强。

图 3 PBC患者肝脏髓系细胞的表达特征

为了阐明肝内T细胞的作用，将T细胞重新聚类并分为11个亚群（图 4a、b)。PBC患者的CD4⁺ CTL、CD8⁺ CTL 和γδT 细胞比例降低，而具有强促炎性质的 Th1 样细胞比例显著升高（图 4c）。总 T 细胞中 IFNG ⁺和 CD4 ⁺ T 细胞比例升高，而 T 细胞中 GZMB ⁺、PRF1 ⁺和 CD8 ⁺ T 细胞比例降低（图 4d）。

参与调节抗原呈递、Th1 和 Th2 细胞分化、细胞黏附和细胞因子-细胞因子受体相互作用的促炎基因（IFNG、CCL4、HLA-DQB1、XCL1、STAT1 等）在 PBC 的 Th1 样细胞中高表达（图 4f）。此外，许多促炎基因（IFNG、IRF1、STAT1、CCL4 等）的表达也在 CD8 ⁺ Trm、NKT 和 MAIT 细胞中增加（图 4g）。

细胞相互作用分析显示，IFN-II、XCR、TNF 和 CD40 信号通路在 Th1 样细胞中显著增强（图 4h）。此外，与 Th1 样细胞和 cDC 细胞中 T 细胞活化和抗原呈递相关的 XCL1、XCL2 和 XCR1 之间的相互作用显著增强（图 4h，i）。总体而言，在炎症增加的细胞亚群中，Th1样细胞的炎症评分和细胞数量变化最为显著，这表明Th1样细胞在PBC中起着主导的促炎作用。

图 4 PBC患者肝脏T细胞的表达特征

发现 Th1 样细胞表达与组织驻留相关的基因，如 CXCR6、CD69、ZNF683和 RBPJ，而几乎不表达与 T 细胞归巢相关的基因，如 SELL（CD62L）和 KLF2（图 5a）。为了进一步明确 Th1 样簇的组织驻留状态，进行重聚类，发现细胞群Cluster3特异性地来源于肝脏，且主要来源是 Th1 样细胞（图 5b，c）。为了进一步验证 Th1 样细胞的存在，对 PBC 患者和健康对照者的肝活检样本进行了流式分析。PBC 患者肝组织中 CD69 ^HI CD4 ⁺ T 细胞的比例增加，且这些细胞高表达 CXCR6（图 5d-f）。

通过对PBC患者肝脏进行免疫荧光染色，发现肝脏浸润的CD4 ⁺ T细胞共同表达组织驻留分子（CD69，CXCR6）和促炎细胞因子（IFNγ，TNFα）（图 5g，h）。有趣的是，这些细胞大多数位于门管区，表明星状细胞可能募集并激活这些CD4 ⁺细胞。CD4 ⁺ CD69 ⁺细胞的数量与APL，DBIL，TBIL，IgG和纤维化程度呈显著正相关（图 5i）。以上结果表明组织驻留Th1样细胞参与了PBC的发展并促进了肝组织的炎症和纤维化。

为了更好地了解Th1样细胞中的转录调控网络，使用SCENIC进行分析，发现Th1样细胞中具有最特异性激活的TF进一步增强，包括RUNX1和STAT1（图 5l），这表明RUNX1和STAT1的激活可能在Th1样细胞的效应功能中发挥重要作用。

图 5 PBC患者肝脏驻留Th1样细胞的特征

为了研究 PBC 免疫的潜在机制，构建了2OA-BSA小鼠模型，分析从对照小鼠和2OA-BSA小鼠模型中分离肝内细胞进行scRNA-seq (图 6a、b )。根据标记基因，细胞大致分为8个簇，包括肝细胞、星状细胞、胆管细胞、内皮细胞、髓系细胞、B细胞、T细胞和循环细胞 (图 6c、d )。发现其中一些基因的表达变化与PBC患者的结果一致，如2OA-BSA 星状细胞的Ccl2、Cxcl5等趋化因子表达水平明显升高，髓系细胞Tnf、Il1b表达增加，T细胞Ifng表达增加（图 6e）。此外，促炎因子受体的表达在胆管细胞或星状细胞中呈增加趋势，如Tnfrsf1a，Tnfrsf1b，Il1r1。总之，这些结果表明胆管细胞和星状细胞可能被Tnf，Il1b和Ifng等促炎因子激活，并产生多种趋化因子来募集免疫细胞来放大炎症信号。

将T细胞重新聚类后，获得12个细胞亚群（图 6f）。在 2OA-BSA 中，具有高 Ifng 表达的 Th1 样细胞群呈增加趋势（图 6g），并表现出组织驻留特征（Sell ^–、Prdm1 ⁺、Cd69 ⁺、Cxcr6 ⁺）（图 6h）。此外，在 2OA-BSA 中，Th1 样细胞中的促炎基因，如 Ifng、Il21、Icos、Stat1、Prdm1 有所增加（图 6i、j）。

Prdm1和Stat1在2OA-BSA小鼠的Th1样细胞中特异性激活（图 6k-m），提示Th1样细胞在人和啮齿动物肝脏中具有相似的转录调控特征。为了验证肝脏驻留 Th1 样细胞的发现，进行了流式细胞术分析。FACS 显示， 2OA-BSA 小鼠 肝脏 CD69 ⁺ CXCR6 ⁺ CD4 ⁺ T 细胞的比例显著增加（图6n）。引人注目的是，2OA-BSA 小鼠的 CD4 + CD69 + T 细胞表现出更高水平的 IFNγ （图6n），这表明具有组织驻留表面分子特征的 CD4 ⁺ T 细胞在 2OA-BSA 小鼠的肝脏中扩增，并且这些细胞通过分泌 IFNγ 表现出独特的 Th1 样特征和促炎能力。

图6 PBC 小鼠肝脏中 Th1 样细胞的特征

该研究中发现了的 JAK/STAT 通路的潜在参与，因此假设巴瑞克替尼（Baricitinib，一种获批用于治疗类风湿性关节炎的 JAK1/JAK2 抑制剂）可能阻断由 Th1 样细胞引起的免疫紊乱。巴瑞克替尼治疗2周后，PBC小鼠肝脏 CD3e ⁺ T 细胞 中 pSTAT1水平降低，血清 IgM-AMA 水平显著降低 (图 7a-c )。门管区炎症细胞浸润显著减少，胆管细胞坏死减轻(图 7d、e )。

此外，分析了JAK-STAT阻断是否影响组织浸润T细胞的扩增。巴瑞克替尼治疗后显著抑制了T细胞扩增，IFNγ和TNFα的表达水平也显著降低（图 7f-h）。巴瑞克替尼治疗后的CD4 ⁺ CD69 ⁺ CXCR6 ⁺ T、CD4 ⁺ CD69 ⁺ CD103 ⁺ T、CD4 ⁺ CD69 ⁺ T-bet ⁺ T 和CD4 ⁺ CD69 ⁺ IFNγ ⁺ T 细胞比例显著下降（图 7g）。这些结果表明：肝脏炎症的减轻与分泌IFNγ的Th1样细胞数减少有关。总之，巴瑞克替尼通过阻断JAK/STAT通路来减轻PBC小鼠的胆管损伤。

图7 巴瑞克替尼可减轻PBC小鼠的胆管损伤

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-53104-9