Cell最新研究 | 揭示了肺癌成纤维网状细胞（FRCs）的抗肿瘤免疫反应

癌症不仅仅是恶性细胞的过度增殖，更是一种与“宿主”复杂相互作用的生态系统。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）是这个生态系统的核心，包含着癌细胞与免疫细胞、成纤维细胞及各种细胞因子之间错综复杂的交互作用。

2024年11月19日，Cell最新研究“Fibroblastic reticular cells generate protective intratumoral T cell environments in lung cancer”，发现成纤维网状细胞（Fibroblastic Reticular Cells, FRCs）在肿瘤微环境中扮演了一个关键的角色。 FRCs通过分泌趋化因子CCL19和CCL21，在肿瘤内部形成了特殊的T细胞环境（T cell Environments, TEs），包括三级淋巴样结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLSs）和T细胞轨迹（T cell tracks）。在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）中，FRCs的存在不仅构建了一个由T细胞组成的网络，而且有效地促进了抗肿瘤免疫反应。理解这些机制对于深入把握肿瘤微环境中的调控路径，以及如何通过调节FRC来优化免疫治疗具有重大意义。

通过免疫组化对7例NSCLC患者的肿瘤样本进行深入研究，发现肿瘤中央区域（Central Margin, CM）与靠近胸膜的边缘区域（Subpleural Margin, SM）内免疫细胞的分布存在显著差异（图1 B）。在CM区域，T细胞和B细胞的密集程度更高，分别为每平方毫米58个和24个细胞，形成了复杂的免疫细胞聚集体（图1 C）。这种聚集被认为是强效免疫反应的关键标志，有助于对肿瘤细胞进行有效的监控和清除。同时，在CM区域，FRC分泌的CCL19和CCL21 mRNA表达水平显著高于SM区域，进一步证实了FRC在调控肿瘤内免疫反应中的重要作用（图1 E）。

高分辨率共聚焦显微镜显示，CM TLS 中存在大量表达 CCL19 和 CCL21的成纤维细胞，其中包含 T 细胞（图1 F）、与 T 细胞相互作用的 CCL19 + FB（图1 G），以及围绕 CD31+血管内皮细胞的CCL19+CCL21+细胞（图1 H）。对高表达CCL19的成纤维细胞进行单细胞转录组分析，发现CCL19+CAF1与lymphoid organ PRCs具有高度相似性，高表达MCAM和NOTCH3（图1 L-M）。CCL19+CAF2与lymphoid organ TRCs具有高度相似性，高表达POSTN、ICAM1和 PDPN（图1 L)。

图 1 CCL19表达的纤维细胞网状细胞在NSCLC肿瘤微环境中的空间分布和功能特征

为了评估 TE 是否单独存在，进行连续切片的高分辨率显微镜分析，表明CCL19⁺FRC 与T 细胞有物理接触（图 2 A-C）。T 细胞道和血管周围微环境中存在 CCL19⁺梯度，这与 T 细胞的空间分布相关（图 2 D-H）。这些数据强调了 CCL19 ⁺ FRC 产生了 NSCLC 中互连 TE 的结构基础。

图 2 非小细胞肺癌中互联 T 细胞的拓扑结构

使用高分辨率共聚焦显微镜，发现 TLS 中的 CCL19+POSTN+PDPN+TRC形成三维网络并与T细胞发生物理相互作用（图3 A）。同样，位于 CM 血管周围空间的 CCL19+MYH11+PRC 与 T 细胞共享表面接触（图3 B）。从 NSCLC 患者的 SM 和 CM 中分选 T 细胞和 B 细胞进行 scRNA-seq 分析，发现CCL19⁺PRC 和 TRC 主要与 CD8⁺T 细胞相互作用。

CD8⁺T亚群分析表明，所有 CD8⁺T 细胞群都与不同 TE 中的 TRC 和 PRC 发生相互作用（图 3D-F）。CCL19⁺FRC与 CD8⁺T之间的细胞间通讯涉及CXCL12、CXCL16、VCAM1等基因（图3 G-I）。共聚焦显微镜分析证实了 TCF7⁺CD3⁺T 细胞和 CCL19⁺ 之间的细胞膜接触（图3 K）。KI67⁺CD8⁺T 细胞与POSTN⁺CCL19⁺TRC细胞之间有相互作用（图3 L）。这些结果表明，CCL19⁺TRC 和 PRC 与 CD8⁺T 细胞之间的相互作用涉及促进特定成纤维细胞微环境发育和调节 T 细胞活性的信号网络。

图 3  非小细胞肺癌中成纤维细胞网状细胞与T 细胞相互作用

轨迹推断表明主要有两种分化途径：SMC/PC分化形成 PRC（T1），而 AdvFB 分化形成TRC（T2）（图4 A-B）。DES和MYH11在轨迹 T1 的起点位置特异性高表达，表明CCL19⁺MYH11⁺DES⁺SMC/PC 可能是PRC的祖细胞（图4 C）。共聚焦显微镜证实 CCL19⁺DES⁺细胞位于 TLS 血管周围区域，且与 CD8⁺T 细胞紧密作用（图4 D）。

RGS5和NOTCH3在T1a分支中高表达，表明 T1a 发育途径有利于产生具有周细胞表型的 PRC（图4 E）。T1b 轨迹中的 PRC 表现出 TNC、CCL21、CXCL12的高表达，与 TLS 中 CD31 ⁺血管附近存在的 CCL19 ⁺ TNC ⁺ PRC 相对应（图4 G-H）。此外，CLU 在T2 轨迹的起始位置显著高表达（图4 I）。共聚焦显微镜证实了 CCL19⁺CLU的存在（图4 J-K）。这些数据表明血管周围成纤维细胞祖细胞分化为肺癌 TE 中表达 CCL19 的 PRC 和 TRC（图4 L）。

图 4 非小细胞肺癌成纤维网状细胞的分化轨迹

为了验证肿瘤内 FRC 与Ccl19阳性祖细胞的分化，构建了LLC-gp33肺癌动物模型 (图5 A)。肿瘤结节主要形成在胸膜下区域，Ccl19-EYFP ⁺细胞与肿瘤内血管周围微环境和 T 细胞道中的浸润性 CD8 ⁺ T 细胞相互作用(图5 B-D)。对Ccl19-EYFP ⁺细胞进行 scRNA-seq 分析，发现肿瘤微环境中存在Sulf1⁺Pdpn⁺TRC 和Rgs5⁺Des⁺PRC（图5 E-F）。共聚焦显微镜显示肿瘤内 T 细胞中存在 EYFP⁺SULF⁺TRC，血管周围微环境存在 EYFP⁺DES⁺PRC（图5 G-H）。

为了识别肿瘤内 TRC 和 PRC 的祖细胞，在肿瘤接种后第 15 天从 Ccl19-EYFP 小鼠中收获了 LLC-gp33 肿瘤，即当 CD8⁺T 已渗入肿瘤并与 LLC-gp33 肿瘤细胞和 Ccl19-EYFP ⁺细胞密切相互作用时（图5 I-J）。并对分选的 Ccl19-EYFP ⁺细胞进行 scRNA-seq 分析，发现第 15 天的Ccl19-EYFP⁺FB 未与第 23 天的 TRC 和 PRC 聚集，表明肿瘤内微环境内的 PRC 和 TRC 分化发生在肿瘤的晚期（图5 K）。分化轨迹推断表明肿瘤中的Sulf1⁺TRC 主要来源于 Cd34⁺AdvFB（T1），而SMC/PC是Rgs5⁺PRC 的祖细胞（T2）（图5 L）。通过细胞命运映射在体内验证了肿瘤 TRC 和 PRC 分化 (图5 M-Q)。综上所述，这些数据表明：肿瘤内 PRC 和 TRC 分别来源于壁内祖细胞和外膜祖细胞，并且沿着不同的发育途径进行分化。

图 5 小鼠肺肿瘤中表达 Ccl19 的成纤维细胞网状细胞亚群

用重组鼠冠状病毒载体 (mCOV-Flt3l-gp33)对携带 LLC-gp33 肿瘤的 Ccl19-EYFP 小鼠进行免疫接种（图 6 A）。引起肿瘤周围和肿瘤内免疫细胞浸润增加，并且 CD8⁺T 细胞在肿瘤 CM 的 TLS 中明显聚集（图6 B）。肿瘤周围 TLS 由 EYFP⁺FRC支撑，EYFP⁺FRC 与 CD8⁺T 细胞发生物理相互作用（图6 C-D）。

对 mCOV-Flt3l-gp33 免疫小鼠的 Ccl19-EYFP ⁺细胞进行scRNA-seq 分析（图6 E-F）。分化轨迹推断表明 Cd34⁺AdvFB 分化为 TLS TRC（图6 G，轨迹 T3）。沿 AdvFB-TLS TRC 轨迹，发生显著变化基因包括趋化因子Cxcl12、Ccl19、Ccl21a和Il33等（图6 H）。体内实验表明：起源于第15天的祖细胞通过克隆增殖促进高度分化的免疫细胞微环境的产生（图6 I-J)。

图6冠状病毒载体免疫治疗中表达Ccl19的成纤维细胞网状细胞亚群

在小鼠模型中，消除肿瘤内的FRC细胞 (DTR+)显著降低了CD8+T细胞的抗肿瘤活性，导致肿瘤体积增大。相反，使用冠状病毒载体激活抗肿瘤免疫反应 (DTR-)，可显著增加肿瘤内CD8+T细胞的数量和活性，并促进TLS的形成（图7 A-E）。对DTR+和DTR-小鼠肺组织进行scRNA-seq 分析，发现effector, effector memory, exhausted, Ccr7+ 和cycling antigen-specific CD8+T cells已浸润到肿瘤（图7 F）。

进一步的生物信息学分析表明，耗竭 CD8⁺T 表现出 “白细胞介导的细胞毒性”相关基因的表达升高，循环CD8 ⁺ T显示出参与“有丝分裂细胞”、“凋亡信号通路”和“淋巴细胞分化”的基因网络激活（图 7 G-H）。总之，这些结果表明 FRC 与TE 中的肿瘤特异性 CD8 ⁺ T 细胞相互作用。

图7 表达 Ccl19的成纤维细胞网状细胞控制抗肿瘤 T 细胞反应

原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01259-5