癌症不仅仅是恶性细胞的过度增殖,更是一种与“宿主”复杂相互作用的生态系统。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)是这个生态系统的核心,包含着癌细胞与免疫细胞、成纤维细胞及各种细胞因子之间错综复杂的交互作用。
2024年11月19日,Cell最新研究“Fibroblastic reticular cells generate protective intratumoral T cell environments in lung cancer”,发现成纤维网状细胞(Fibroblastic Reticular Cells, FRCs)在肿瘤微环境中扮演了一个关键的角色。 FRCs通过分泌趋化因子CCL19和CCL21,在肿瘤内部形成了特殊的T细胞环境(T cell Environments, TEs),包括三级淋巴样结构(Tertiary Lymphoid Structures, TLSs)和T细胞轨迹(T cell tracks)。在非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)中,FRCs的存在不仅构建了一个由T细胞组成的网络,而且有效地促进了抗肿瘤免疫反应。理解这些机制对于深入把握肿瘤微环境中的调控路径,以及如何通过调节FRC来优化免疫治疗具有重大意义。
研究结果
01
成纤维细胞网状细胞支撑肺癌中互连的 T 细胞环境
通过免疫组化对7例NSCLC患者的肿瘤样本进行深入研究,发现肿瘤中央区域(Central Margin, CM)与靠近胸膜的边缘区域(Subpleural Margin, SM)内免疫细胞的分布存在显著差异(图1 B)。在CM区域,T细胞和B细胞的密集程度更高,分别为每平方毫米58个和24个细胞,形成了复杂的免疫细胞聚集体(图1 C)。这种聚集被认为是强效免疫反应的关键标志,有助于对肿瘤细胞进行有效的监控和清除。同时,在CM区域,FRC分泌的CCL19和CCL21 mRNA表达水平显著高于SM区域,进一步证实了FRC在调控肿瘤内免疫反应中的重要作用(图1 E)。
高分辨率共聚焦显微镜显示,CM TLS 中存在大量表达 CCL19 和 CCL21的成纤维细胞,其中包含 T 细胞(图1 F)、与 T 细胞相互作用的 CCL19 + FB(图1 G),以及围绕 CD31+血管内皮细胞的CCL19+CCL21+细胞(图1 H)。对高表达CCL19的成纤维细胞进行单细胞转录组分析,发现CCL19+CAF1与lymphoid organ PRCs具有高度相似性,高表达MCAM和NOTCH3(图1 L-M)。CCL19+CAF2与lymphoid organ TRCs具有高度相似性,高表达POSTN、ICAM1和 PDPN(图1 L)。
图 1 CCL19表达的纤维细胞网状细胞在NSCLC肿瘤微环境中的空间分布和功能特征
为了评估 TE 是否单独存在,进行连续切片的高分辨率显微镜分析,表明CCL19+FRC 与T 细胞有物理接触(图 2 A-C)。T 细胞道和血管周围微环境中存在 CCL19+梯度,这与 T 细胞的空间分布相关(图 2 D-H)。这些数据强调了 CCL19 + FRC 产生了 NSCLC 中互连 TE 的结构基础。
图 2 非小细胞肺癌中互联 T 细胞的拓扑结构
02
NSCLC 中 FRC-CD8 T 细胞相互作用的分子通路
使用高分辨率共聚焦显微镜,发现 TLS 中的 CCL19+POSTN+PDPN+TRC形成三维网络并与T细胞发生物理相互作用(图3 A)。同样,位于 CM 血管周围空间的 CCL19+MYH11+PRC 与 T 细胞共享表面接触(图3 B)。从 NSCLC 患者的 SM 和 CM 中分选 T 细胞和 B 细胞进行 scRNA-seq 分析,发现CCL19+PRC 和 TRC 主要与 CD8+T 细胞相互作用。
CD8+T亚群分析表明,所有 CD8+T 细胞群都与不同 TE 中的 TRC 和 PRC 发生相互作用(图 3D-F)。CCL19+FRC与 CD8+T之间的细胞间通讯涉及CXCL12、CXCL16、VCAM1等基因(图3 G-I)。共聚焦显微镜分析证实了 TCF7+CD3+T 细胞和 CCL19+ 之间的细胞膜接触(图3 K)。KI67+CD8+T 细胞与POSTN+CCL19+TRC细胞之间有相互作用(图3 L)。这些结果表明,CCL19+TRC 和 PRC 与 CD8+T 细胞之间的相互作用涉及促进特定成纤维细胞微环境发育和调节 T 细胞活性的信号网络。
图 3 非小细胞肺癌中成纤维细胞网状细胞与T 细胞相互作用
03
FRC 亚群在 NSCLC 中的分化途径
轨迹推断表明主要有两种分化途径:SMC/PC分化形成 PRC(T1),而 AdvFB 分化形成TRC(T2)(图4 A-B)。DES和MYH11在轨迹 T1 的起点位置特异性高表达,表明CCL19+MYH11+DES+SMC/PC 可能是PRC的祖细胞(图4 C)。共聚焦显微镜证实 CCL19+DES+细胞位于 TLS 血管周围区域,且与 CD8+T 细胞紧密作用(图4 D)。
RGS5和NOTCH3在T1a分支中高表达,表明 T1a 发育途径有利于产生具有周细胞表型的 PRC(图4 E)。T1b 轨迹中的 PRC 表现出 TNC、CCL21、CXCL12的高表达,与 TLS 中 CD31 +血管附近存在的 CCL19 + TNC + PRC 相对应(图4 G-H)。此外,CLU 在T2 轨迹的起始位置显著高表达(图4 I)。共聚焦显微镜证实了 CCL19+CLU的存在(图4 J-K)。这些数据表明血管周围成纤维细胞祖细胞分化为肺癌 TE 中表达 CCL19 的 PRC 和 TRC(图4 L)。
图 4 非小细胞肺癌成纤维网状细胞的分化轨迹
04
小鼠肺癌中的成纤维细胞网状细胞分化
为了验证肿瘤内 FRC 与Ccl19阳性祖细胞的分化,构建了LLC-gp33肺癌动物模型 (图5 A)。肿瘤结节主要形成在胸膜下区域,Ccl19-EYFP +细胞与肿瘤内血管周围微环境和 T 细胞道中的浸润性 CD8 + T 细胞相互作用(图5 B-D)。对Ccl19-EYFP +细胞进行 scRNA-seq 分析,发现肿瘤微环境中存在Sulf1+Pdpn+TRC 和Rgs5+Des+PRC(图5 E-F)。共聚焦显微镜显示肿瘤内 T 细胞中存在 EYFP+SULF+TRC,血管周围微环境存在 EYFP+DES+PRC(图5 G-H)。
为了识别肿瘤内 TRC 和 PRC 的祖细胞,在肿瘤接种后第 15 天从 Ccl19-EYFP 小鼠中收获了 LLC-gp33 肿瘤,即当 CD8+T 已渗入肿瘤并与 LLC-gp33 肿瘤细胞和 Ccl19-EYFP +细胞密切相互作用时(图5 I-J)。并对分选的 Ccl19-EYFP +细胞进行 scRNA-seq 分析,发现第 15 天的Ccl19-EYFP+FB 未与第 23 天的 TRC 和 PRC 聚集,表明肿瘤内微环境内的 PRC 和 TRC 分化发生在肿瘤的晚期(图5 K)。分化轨迹推断表明肿瘤中的Sulf1+TRC 主要来源于 Cd34+AdvFB(T1),而SMC/PC是Rgs5+PRC 的祖细胞(T2)(图5 L)。通过细胞命运映射在体内验证了肿瘤 TRC 和 PRC 分化 (图5 M-Q)。综上所述,这些数据表明:肿瘤内 PRC 和 TRC 分别来源于壁内祖细胞和外膜祖细胞,并且沿着不同的发育途径进行分化。
图 5 小鼠肺肿瘤中表达 Ccl19 的成纤维细胞网状细胞亚群
05
通过基于冠状病毒载体的抗肿瘤疫苗接种形成诱导型 TLS
用重组鼠冠状病毒载体 (mCOV-Flt3l-gp33)对携带 LLC-gp33 肿瘤的 Ccl19-EYFP 小鼠进行免疫接种(图 6 A)。引起肿瘤周围和肿瘤内免疫细胞浸润增加,并且 CD8+T 细胞在肿瘤 CM 的 TLS 中明显聚集(图6 B)。肿瘤周围 TLS 由 EYFP+FRC支撑,EYFP+FRC 与 CD8+T 细胞发生物理相互作用(图6 C-D)。
对 mCOV-Flt3l-gp33 免疫小鼠的 Ccl19-EYFP +细胞进行scRNA-seq 分析(图6 E-F)。分化轨迹推断表明 Cd34+AdvFB 分化为 TLS TRC(图6 G,轨迹 T3)。沿 AdvFB-TLS TRC 轨迹,发生显著变化基因包括趋化因子Cxcl12、Ccl19、Ccl21a和Il33等(图6 H)。体内实验表明:起源于第15天的祖细胞通过克隆增殖促进高度分化的免疫细胞微环境的产生(图6 I-J)。
图6冠状病毒载体免疫治疗中表达Ccl19的成纤维细胞网状细胞亚群
06
成纤维细胞网状细胞控制抗肿瘤 T 细胞反应
在小鼠模型中,消除肿瘤内的FRC细胞 (DTR+)显著降低了CD8+T细胞的抗肿瘤活性,导致肿瘤体积增大。相反,使用冠状病毒载体激活抗肿瘤免疫反应 (DTR-),可显著增加肿瘤内CD8+T细胞的数量和活性,并促进TLS的形成(图7 A-E)。对DTR+和DTR-小鼠肺组织进行scRNA-seq 分析,发现effector, effector memory, exhausted, Ccr7+ 和cycling antigen-specific CD8+T cells已浸润到肿瘤(图7 F)。
进一步的生物信息学分析表明,耗竭 CD8+T 表现出 “白细胞介导的细胞毒性”相关基因的表达升高,循环CD8 + T显示出参与“有丝分裂细胞”、“凋亡信号通路”和“淋巴细胞分化”的基因网络激活(图 7 G-H)。总之,这些结果表明 FRC 与TE 中的肿瘤特异性 CD8 + T 细胞相互作用。
图7 表达 Ccl19的成纤维细胞网状细胞控制抗肿瘤 T 细胞反应
原文链接:https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01259-5
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