全基因组甲基化
全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）是将重亚硫酸盐（Bisulfite）处理方法和Illumina高通量测序相结合，对有参考基因组信息的物种进行全基因组范围内的甲基化水平检测。WGBS可以精确到单碱基分辨率，精确分析每一个C碱基的甲基化状态，可以达到全基因组覆盖, 是研究甲基化水平的“金标准”。WGBS满足全基因组甲基化图谱、疾病关联分析、基因调控分析、疾病的甲基化标志物筛选等探索性课题研究。
生物信息学分析内容
简化甲基化测序RRBS
简化甲基化测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS）通过酶切富集启动子及 CpG 岛区域，并进行 Bisulfite 测序，同时 实现 DNA 甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。作为一种高性价比的甲基化研究方法，简化甲基化测序在大规模 临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
MeRIP-seq
在转录后修饰中，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰之一。目前发现microRNA，circRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有m6A修饰。m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能主要由Writer、Eraser和Reader决定。Writer即甲基转移酶，目前已知这个复合物的成分有METTL3，METTL14, METTL16, WTAP和KIAA1429等。而ALKBH5和FTO作为去甲基酶（Eraser）可逆转甲基化。目前发现m6A结合蛋白（Reader）有YTH结构域蛋白（YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3,YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。
MeRIP-seq则是研究m6A修饰强有力的技术之一。MeRIP-seq是将MeDIP、RIP及RNA-seq技术结合起来，在全基因组范围内检测RNA甲基化。利用特异性的RNA甲基化抗体进行免疫共沉淀反应，将获得的甲基化修饰片段进行测序，同时，设计Input对照样本消除背景。
技术优势
携手RNA甲基化研究国际知名团队，深度优化实验与分析流程；
提炼数十篇顶级RNA甲基化文章思路，量身定制前沿实验方案；
提供多组学整合分析与功能验证一站式服务，大幅缩短实验周期；
一流的数据挖掘团队+丰富的论文审稿经验，加速科研成果发表。
样本起始量与送样建议
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样本类型 |
起始量 |
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细胞 |
>5x106 |
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动物组织 |
>100 mg |
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植物 |
>5 g |
注意事项：详细样本准备指南，请联系在线客服。
分析内容
1. 测序序列统计与质控
2. 参考基因组比对：参考基因组比对Reads统计、参考基因组比对区域分布、测序数据比对分布
3. 全基因组Peak扫描：Peak calling、Peak注释
4. 差异Peak分析：差异Peak信息统计、差异Peak基因GO富集分析、差异Peak基因KEGG富集性分析
5. Motif分析
案例展示
客户案例1：m6A调控miRNA初级体识别加工
论文标题：N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing
刊登日期：2015年03月
发表杂志：Nature
影响因子：40.1
研究机构：美国洛克菲勒大学
在miRNA生物合成的第一步是在微处理蛋白复合物的帮助下对初级microRNA（pri-miRNA）进行加工。微处理蛋白复合物由RNA结合蛋白DGCR8和III型核糖核酸酶Drosha组成。这个起始事件需要DGCR8识别pri-miRNA发夹上茎和侧翼单链RNA的连接处，并招募Drosha剪切双链RNA产生前体miRNA（pre-miRNA）。pri-miRNA的加工机制已经被阐释，但是目前并不知道DGCR8在众多具有二级结构的转录本中识别和结合pri-miRNA的机制。
本研究中，洛克菲勒大学Dr.Tavazoie教授发现在哺乳动物细胞中，METTL3会使pri-miRNA发生甲基化，标记的pri-miRNA可以被DGCR8的识别和加工。通过miRNA芯片分析发现，敲低METTL3会降低DGCR8与pri-miRNA的结合作用，引起成熟体miRNA表达量降低，通过未经加工pri-miRNA含量增加。体外实验证实m6A会促进pri-miRNA的加工。最后，功能验证实验揭示METTL3能够促使miRNA成熟。所以m6A标记是一个关键的转录后修饰，会促进miRNA生物合成的起始。
客户案例2：m6A识别酶HNRNPA2B1介导RNA加工
论文标题：HNRNPA2B1 Is a Mediator of m6A-Dependent Nuclear RNA Processing Events
刊登日期：2015年09月
发表杂志：Cell
影响因子：30.4
研究机构：美国洛克菲勒大学
已知m6A是mRNA中最普遍的一种内部修饰方式之一。各种转录本如mRNA、lncRNA等上携带的m6A修饰能够影响RNA在细胞核中的“命运”如RNA降解以及转录后加工等。洛克菲勒大学Dr.Tavazoie教授在文中验证了一种RNA结合蛋白HNRNPA2B1能够特异性识别转录本上的m6A修饰。这些发生m6A修饰的位点所在的motif与甲基化转移酶METTL3 motif相匹配。此外HNRNPA2B1能够直接与发生m6A修饰的miRNA初级体（pri-miRNA）相结合，与miRNA微处理蛋白复合物之一DGCR8一起促使pri-miRNA成熟体的加工。
参考文献
1. Alarcón C R, Lee H, Goodarzi H, et al. N6-methyl-adenosine (m6A) marks primary microRNAs for processing[J]. Nature, 2015, 519(7544):482.
2. Alarcón C R, Goodarzi H, Lee H, et al. HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events.[J]. Cell, 2015, 162(6):1299-1308.
常见问题
1.样本处理有什么特殊的要求吗？
样本处理方法根据实验室是否有液氮分为如下两种情况：
有液氮的情况：
组织样品离体后，快速用RNase-free配制的生理盐水/PBS清洗样本表面的污渍，并吸干表面的液体，迅速的将样本分割成长宽高<=0.5cm的小块（一般重约100mg，不过无需精准测量，一般需要10个小块左右），将样本放入已标记好名称且预冷好的Rnase-free的螺纹管中（不要将盖子拧死，以免从液氮中取出时破裂），迅速投入液氮中速冻>=1h，然后取出置于-80℃保存，干冰运输。
没有液氮的情况：
提前准备好RNase-free的1.5mL的EP管，向其中加入1mL的RNAfixer。
组织样品离体后，快速用RNase-free生理盐水/PBS清洗样本表面的污渍，并吸干表面的液体，迅速的将样本分割成长宽高<=0.5cm，约豌豆大小的小块（一般重约100mg，不过无需精准测量，一般需要10个小块左右），然后投入提前准备好的1.5mL的EP管中，使样本完全浸没在液体中，然后置于-80℃中保存，干冰运输。
注意：实验操作过程中请务必确保无RNA酶污染。
2.m6A检测方法有哪些，只能用测序的方法来检测吗？
定量方法：LC-MS/MS、EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit（比色法）
高通量测序：m6A-seq（MeRIP-seq）、miCLIP-seq
定量方法只能检测整体m6A水平，无单碱基分辨率；但是测序方法则没有此限制。您可以根据实验的具体需求选择对应的检测方法。
ATAC-seq
在有限的细胞核空间中，基因组的大部分是紧密折叠的，仅留下需要转录的部分是开放的。活化的调控序列上结合有转录因子，转录因子会招募其他蛋白启动基因转录。人体内有些基因几乎一直处于开启状态，有些基因用过之后就被闲置在一边，它们的活性都处于严格的调控之下。ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing），利用DNA转座酶结合高通量测序技术，来研究染色体的可进入性。ATAC-seq 只需要很少的细胞就能鉴定基因组中所有活跃的调控序列。
生物信息学分析内容
Chip-seq
结合染色质免疫共沉淀技术（ChIP）和高通量测序技术，对目的蛋白结合的 DNA 片段进行测序，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白修饰、转录因子等互作的 DNA 区段。
生物信息学分析内容
Cut & tag
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术彻底改变了ChIP-seq实验的细胞量需求，使其从原先的10,000个大幅降低到了60个，甚至单个细胞，这无疑是对生物学研究领域的一次重大突破。CUT&Tag技术的出现，不仅极大地提高了实验的可行性和效率，更在传统ChIP-seq实验中存在的信噪比和数据重复性等问题方面实现了质的飞跃。
CUT&Tag技术是一种革新性的蛋白质-DNA互作研究方法，其独特之处在于它不需要使用免疫共沉淀，而是通过针对靶蛋白的抗体和Protein A的介导，成功实现了Tn5酶（已与Protein A融合）在切割DNA片段的同时，在序列两端添加测序接头。经PCR扩增后，可以直接生成用于高通量测序的文库。
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